Новые тиоцианатдегидрогеназы из сероокисляющих бактерий ThiohalobacterthiocyanaticusHRH1T и Guyparkeriasp.SCN-R1

Хемолитоавтотрофные галофильные сероокисляющие (SOB) бактерии Thiohalobacter thiocyanaticus HRh1T и Guyparkeria sp. SCN-R1 способны использовать тиоцианат в качестве единственного источника энергии, азота и серы. Ранее было пока-зано, что процесс окисления тиоцианата в этих бактериях осуществляется по “цианатному пути”. Оба генома кодируют гомо-логи медь-содержащего фермента тиоцианатдегидрогеназы (TcDH), окисляющего тиоцианат по “цианатному пути” у пред-ставителей галоалкалофильных SOB рода Thioalkalivibrio. Однако, несмотря на наличие консервативных мотивов в белке, характерных для TcDH, общая гомология аминокислотных последовательностей по отношению к TcDH из Thioalkalivibrio не превышает 34 %. Кроме того, отличается окружение гена TcDH в соответствующем генном локусе. В частности, вместо си-стемы транспорта меди Cop присутствует альтернативная система Cus.
TcDH из Thiohalobacter thiocyanaticus была выделена из лизата клеток, выращенных на тиоцианате. Наличие белка WP_0065748988 было подтверждено методом MALDI-TOF. Полученный препарат обладает тиоцианатдегидрогеназной актив-ностью.
Для проведения дальнейших функциональных и структурных исследований гены соответствующих белков были клониро-ваны в плазмидный вектор pHIS-Parallel3. Экспрессию белков в клетках E. coli. Очистку белков проводили методом аффинной хроматографии на Ni-агарозе с последующей гель-фильтрацией. Оба рекомбинантных белка в растворе существуют в виде агрегатов с различной молекулярной массой. После насыщения полученных белков ионами меди ферментативной активности в реакции окисления тиоцианата обнаружить не удалось.
Последовательности исследуемых белков содержат 6-7 остатков Cys. В кластере генов, предшествующем гену TcDH в этих бактериях, кодируется белок, принадлежащий к суперсемейству тиоредоксина. Существует вероятность, что этот белок способствует фолдингу TcDH. Для проверки этого предположения ген Guyparkeria клонировали в модифицированный плаз-мидный вектор pET-32a, содержащий тиоредоксин в качестве белка-носителя. Клетки E. coli с рекомбинантной плазмидой культивировали в среде М9 с добавлением ионов меди и микроэлементов. Очищенный рекомбинантный белок обладал мень-шей склонностью к агрегации по сравнению с полученным ранее и обладал тиоцианатдегидрогеназной активностью.